Next-Generation-Sequencing (NGS)

Die NGS bietet verschiedene genomweite Analysen auf der Grundlage der Next-Generation-Sequenzierungstechnologie an. Die Methoden umfassen in erster Linie Genexpressions- und
Chromatin-basierte Analysen wie RNA-Seq, Methyl-Seq, ChIP-Seq, ATAC-Seq usw. Ein Schwerpunkt liegt dabei auf Einzelzell (single cell) Transkriptom-Analysen (scRNA-Seq).
Unser Beitrag zu den Projekten beginnt mit der Beratung und Planung, gefolgt von der Qualitätskontrolle nach Übernahme des zu analysierenden Materials, verschiedene Anreicherungsbzw. Abreicherungsmethoden je nach Fragestellung, Präparation der Sequenzierbibliotheken und die Sequenzierung dieser Bibliotheken. Mit der umfangreichen Erfahrung in der bioinformatischen Auswertung solcher Experimente wird auch die anschließende Daten-Auswertung in enger Absprache mit den Nutzern/den Kooperationspartnern bis zur Publikationsreife durchgeführt incl. aller gewünschten Abbildungen, die Methodenbeschreibung, die für die Publikation geforderte Deponierung der Daten in einer öffentlichen Datenbank sowie die sichere Langzeit–Archivierung aller Daten.

Leiter: Prof. Dr. André Reis
Ansprechpartner: Dr. Arif B. Ekici

Mission
Die Core Unit Next Generation Sequencing (NGS-CU) wird von der Medizinischen Fakultät getragen und vom Humangenetischen Institut betrieben. Ziel der Core Unit (CU) ist es, eine kosten- und zeiteffiziente Nutzung von Spitzentechnologie für Genomanalysen zur Verfügung zu stellen und dies auch mit Beratung bei der Projektplanung und der anschließenden Datenanalyse zu gewährleisten.

Angebot
Wir bieten Analysen mittels NGS für Projekte aus dem UKER, den Instituten und Departments der FAU, aber auch für externe Forschungs-Kooperationspartner. Das Leistungsspektrum umfasst dabei auch die Beratung bei der Projektplanung und die anschließende (primäre) Datenanalyse. Die Methoden umfassen eine große Bandbreite verschiedener genomweite Analysen: whole transcriptome-, whole methylome-, ChIP- und ATAC-sequencing. Neu hinzugekommen ist die Möglichkeit der Transkriptom-Analyse auf Einzelzellebene, die wir auf der Chromium-Plattform der Firma 10xGenomics durchführen (single cell-RNASeq). Hier finden Sie die Nutzerordnung der Core Unit Next Generation Sequencing.

Was machen wir genau?
Unser Beitrag an den Projekten umfasst dabei die Qualitätskontrolle nach Übernahme des zu analysierenden Materials, je nach Fragestellung verschiedene Anreicherungs- bzw. Abreicherungsmethoden, Präparation der Sequenzierbibliotheken und die Sequenzierung dieser Bibliotheken. Die Daten-Auswertung führen wir in enger Absprache mit dem Nutzer/den Kooperationspartnern durch. Für die NGS-Methoden können wir auf die Plattform der Firma Illumina (HiSeq-2500) zurückgreifen. Wir verfügen über umfangreiche Erfahrung in der Durchführung und der bioinformatischen Auswertung solcher Experimente und haben hierzu robuste und zuverlässige Verfahren entwickelt und angewandt.

Tipps zu Bulk-RNAseq

Für eine sichere statistische Analyse sollte dringend die Analyse von je mind. drei biologischen Replikaten eingeplant werden. Aus Erfahrung kann man aber sagen, dass erst mind. vier Replikate eine Redundanz gegen Ausfall von einzelnen Proben bieten („outlier“). Wir benötigen netto 100-1000ng RNA-Menge, versuchen aber eher im oberen Bereich in die Prozessierung zu gehen. Für die QC per BioAnalyzer etc. benötigen wir noch einige zusätzliche uL Volumen. Deswegen sollten wir Volumina von mind. 10-20 uL bekommen. Wir bekommen die meisten RNA aus Qiagen- bzw. Phenol-basierten Extraktionen. Das Poolen von biol. Replikaten beeinträchtigt nicht die Laborprozessierung, in der Datenanalyse kann man dann aber lediglich nur eine „Summenaussage“ machen. Dies wird deshalb nur bei zu geringem Material gemacht: z.B. sortierte Zellen, zu geringe Zellzahl bei „Laser Capture Microdissection“ etc.
Für die uns überlassenen Total-RNA-Proben führen eine Qualitätskontrolle (Agilent BioAnalyzer) durch und melden uns bei Ihnen mit QC-Ergebnissen. Bei ausreichender Qualität erstellen wir die Sequenzier-Bibliotheken und führen die Sequenzierung durch. Die bioinformatische Datenanalyse führen wir in enger Abstimmung mit Ihnen durch und stehen für Ihre Wünsche bei der graphischen Darstellung der Ergebnisse zu Verfügung.

Tipps zu single cell-RNAseq

Für diese Analyse brauchen wir eine Vorlaufzeit von 2-3 Wochen. Entsprechend machen wir vorab einen Termin für die Übergabe der frischen Zellsuspension aus, vorzugsweise an einem Dienstag oder Mittwoch. Details der benötigten Quantität und Qualität der Zellen werden wir vorab mit Ihnen besprechen, ebenso wie die erforderliche Sequenziertiefe. In der Regel strebt man eine Mindestzahl von 5.000 Zellen/Gruppe/Analyse an. Wenn die Sequenzier-Bibliotheken erfolgreich erstellt wurden, melden wir uns bei Ihnen mit den QC-Ergebnissen. Auch hier führen wir nach der Sequenzierung die bioinformatische Datenanalyse in enger Abstimmung mit Ihnen durch.

Einige wichtige Punkte, die vorab geklärt sein sollten

  • Die RNA-Proben sollten Total-RNA sein, daran lässt sich die Qualität am besten ermitteln. Wir brauchen Informationen, wie Volumen, Menge, Konzentration und sonstige QC-Daten, soweit vorhanden.
  • Alle RNA sollten sicher und gut DNAse-verdaut sein. Bitte die Methode auflisten.
  • Bei allen Proben sollten Sie uns Angaben, wie Spezies, Gewebe, bei Zellkultur auch Zelltyp, nennen, bei sortierten Zellen die Anzahl der Zellen.
  • Sind Transkripte aus einem Fremdorganismus zu erwarten, z. B. infolge Transfektion?
  • Alle Proben sollten sowohl in den mitgelieferten Daten als auch auf den Tubes gleichlautend und so kurz wie möglich benannt werden.
  • Gibt es eine bevorzugte Referenz oder ein bevorzugtes Genmodell? Wir verwenden standardmäßig: hg19/38, mm38, Rnor5/6 und das aktuelle Ensembl-Genmodell.
  • Welche paarweisen oder geblockten Vergleiche der Proben sind sinnvoll? Definition von Probengruppen für die Datenanalyse!
  • Sind Gene mit differentieller Expression als Positivkontrollen bekannt (z. B. per qPCR getestet)?
  • Wird eine sehr hohe oder eine sehr niedrige Anzahl exprimierter Gene vermutet?
  • Sind Batch-Effekte bekannt? Wenn ja: welche Proben gehören in welche Batches?
  • Sample-ID (wie auf den Eppis)
  • Volumen
  • Konzentration
  • Extraktionsart (Kit)

Alle nötigen Daten der Proben benötigen wir tabellarisch in elektronischer Form und stellen dafür eine Vorlage zu Verfügung.

Was kosten die Analysen?

Die Analyse-Kosten richten sich nach der Fragestellung. Häufig nachgefragte Analysen und ihre Kosten sind:
Analyse Einzelpreis (€)
3′-scRNA-Seq 2.995
Multiome 3′-scRNA-Seq & scATAC-Seq 5.395
5′-scRNA-Seq (plus B- oder T-Zelle) 3.495
5′-scRNA-Seq (plus B- und T-Zelle) 4.095
Immunrepertoire-Seq (VDJ; nur B- oder T-Zelle) 2.495
Sequenzierung fertiger 3′-scRNA-Seq Libraries 995
Bulk-RNA-Seq 395
Enrichment-Seq (ATAC-Seq/ChIP-Seq/RRBS etc.) 295
Sequenzierung fertiger PCR-Produkt-Libraries 120

Die Preise gelten nur für Projekte aus dem Universitätsklinikum oder FAU, da es sich um einen durch die Fakultät subventionierten Service handelt. Für Projekte von außerhalb Erlangens gelten andere Preise und die MwSt. kommt auch noch dazu. Für weitere Informationen kontaktieren Sie bitte Arif Bülent Ekici.

Diese Kosten decken sämtliche Sachkosten für die Experimente und die anteiligen Kosten für projekt-bezogene Personalkosten, und beinhalten die Aufbereitung und Bereitstellung der Daten in geeigneter Form für die eigene weitergehende Datenanalyse. Dieser Service bedingt keine formelle Kooperation, ein „Acknowledgement“ wäre angebracht. Darüber hinausgehende detaillierte bioinformatische Datenanalysen auf Kooperationsbasis sind natürlich möglich und werden in der Regel auch gerne in Anspruch genommen.

Die Abrechnung erfolgt über interne Leistungsverrechnung. Wir schicken Ihnen ein entsprechendes Formular zu, indem die Probenzahl vermerkt ist. Sie schicken uns dann dieses Formular, um die Kostenstelle ergänzt und unterschrieben, wieder zurück. Bei Projekten aus der Universität stellen wir stattdessen eine Rechnung aus.
Bei Projekten außerhalb Erlangens gelten andere Preise, und es muss auch die MwSt. berechnet und abgeführt werden.
Weitere Informationen
Arif Bülent Ekici

Nutzerordnung_CU NGS_29.03.2022